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      MDCK.STAT1KO 細胞——流感疫苗的新選擇

      據報道,目前每年都會有20%的人感染流感病毒,接種流感疫苗是抵御病毒的有效防范措施。

      傳統的流感疫苗采用將流感病毒株接種到雞胚,經培養、收獲病毒液,病毒滅活、純化等步驟制成。這種工藝路線成本相對較高,而且污染微生物的風險較高,對接種者有可能引起過敏反應。因而,利用哺乳動物細胞作為細胞基質生產疫苗是另外一種選擇,有利于迅速實現規?;a。

      2012年,美國FDA批準Flucelvax作為第一個哺乳動物細胞(MDCK)生產的美國流感疫苗。

      對于疫苗生產來說,如何優化工藝,最大程度的提高產能,降低生產成本,一直是永恒的話題。除了優化下游的步驟,是否有可能從上游細胞入手,通過改變關鍵基因獲得產病毒能力更高的MDCK細胞株?

       

      ATCC把目標鎖定在了STAT1基因。

      STAT1蛋白是細胞干擾素抗病毒應答的重要分子。ATCC通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術成功敲除MDCK STAT1基因,開發了一個新的細胞模型MDCK.STAT1KO (ATCC® CCL-34-VHG)。

      實驗證明基因編輯后的細胞沒有STAT1蛋白表達,與親本細胞系相比,病毒產生能力明顯增加,接種甲型流感(H1N1;ATCC®VR-1736™)后,病毒滴度提高了30倍。

      圖1. 甲型流感(H1N1;ATCC®VR-1736™) 接種 STAT1-KO-MDCK 細胞實驗結果。(A)MDCK WT 親本和 MDCK.STAT1 型 KO 細胞,接種甲型流感,48小時后收集細胞上清液。綠色-抗流感病毒染色,藍色-核染色。(B)感染甲型流感病毒48小時后細胞上清液的TCID50值。(C) RT-PCR法定量檢測感染48小時后甲型流感病毒基因組拷貝數。

      圖2. STAT1-KO-MDCK 細胞特征。(A)MDCK.STAT1KO 細胞 STAT1 基因測序結果證實STAT1基因斷裂。(B)測序結果顯示,MDCK.STAT1KO 細胞是一個雜合子。一條等位基因存在單一堿基插入,另一個等位基因存在4堿基的缺失。(C)WB結果顯示,無論是低代次還是高代次, MDCK.STAT1KO 細胞都沒有 STAT1  蛋白表達。

      圖3. STAT1-KO-MDCK 細胞無 Cas9/CMV 基因序列的整合。

      圖4. STAT1-KO-MDCK 細胞,未發現脫靶效應導致的非靶向突變。

       

      改良后的MDCK細胞(MDCK.STAT1KO (ATCC® CCL-34-VHG))大大提高了病毒生產滴度,穩定的STAT1敲除基因型,無Cas9/CMV 基因序列的整合,無脫靶導致的突變。以上特征使得該細胞成為基礎研究、病毒疫苗生產的一個優質細胞模型。
       

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